微生物培养技术
实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒
实验二 土壤中微生物分离纯化培养
实验三 菌种保藏
实验四 细菌形态观察及单染色
实验五 放线菌及霉菌形态观察
实验六 革兰氏染色及芽孢染色
实验七 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定
实验八 微生物直接计数法及测微技术
实验九 大肠杆菌生长曲线的测定
实验十 水中细菌总数的测定
实验十一细菌细胞的生化反应实验
实验十二噬菌体的分离、纯化及效价测定
实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒
一、实验目的
了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。
二、实验原理
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。
干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。
三、试剂与器材
1.器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。
2.试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂
四、实验内容
1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查
2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物
3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查
4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌
五、关键步骤及注意事项
1.要严格按配方配制。
2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。
4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。
5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。
实验二 土壤中微生物分离纯化培养
一、实验目的
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。
二、实验原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法 稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。
三、试剂与器材
1.器材 盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。
2.试剂 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基
四、实验内容
1.土壤稀释液的制备
2.微生物分离纯化：稀释涂平板法，平皿划线分离法，微生物培养技术
五、关键步骤及注意事项
1.掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。
2.平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。
实验三 菌种保藏
一、实验目的
1.学习并掌握菌种保藏的基本原理。
2.掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。
二、实验原理
微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法
三、试剂与器材
1.材料 大肠杆菌、青霉菌、放线菌
2.试剂 液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰
3.器材 无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(—30℃)、超低温冰箱和液氮罐等。
四、实验内容
1.斜面保藏法
2.液体石蜡法
3.穿刺保藏法
4.砂土管保藏法
5.冷冻真空干燥保存法
五、关键步骤及注意事项
1.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。
2.熔封安瓶时防止封闭不严。
3.液氮冻存操作应防止冻伤。
实验四 细菌形态观察及单染色
一、实验目的
1.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。
2.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
3.巩固显微镜(油镜)的使用方法。
4.初步认识细菌的形态特征。
二、实验原理
细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色。
三、试剂与器材
1.材料 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌
2.试剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液。
3.器材 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等。
四、实验内容
简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
五、关键步骤及注意事项
1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，
2.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。
实验五 放线菌及霉菌形态观察
一、实验目的
1.了解放线菌、霉菌形态观察的原理。
2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。
3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。
二、实验原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。
霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。
插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。
三、试剂与器材
1.材料 黑曲霉、青霉和根霉，细黄链霉菌或青色链霉菌，灭菌的高氏I号琼脂和灭菌的查氏培养基。
2.实验器材 经灭菌的：平皿、玻璃纸、无菌吸管、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜等。
四、实验内容
倒平板→接种→插片→培养→镜检
五、关键步骤及注意事项
1.倒平板要厚一些，接种时划线要密。
2.插片时要有一定角度并与划线垂直。
3.观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。
4.如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。
实验六 革兰氏染色及芽孢染色
一、实验目的
1.了解革兰氏染色法和芽孢染色法的原理，并掌握其操作方法。
2.了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
4.学习显微镜(油镜)的使用方法。
5.初步认识细菌的形态特征。
二、实验原理
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。
芽孢染色法的基本原理，用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
三、试剂与器材
1.材料：枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物
2.试剂 革兰氏染色液(结晶紫液、碘液、95％乙醇、番红液)。5％孔雀绿水溶液
3.实验器材 小试管、滴管、烧杯、试管架、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、凹载玻片、无菌水、显微镜等、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。
四、实验内容
1.革兰氏染色法 制片→初染→媒染→脱色→复染→镜检。
2.Schaefer-Fulton氏染色法 制片→染色→水洗→复染→水洗→镜检。
五、关键步骤及注意事项
1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，
2.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，严格掌握脱色时间。
实验七 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定
一、实验目的
1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。
2.学习鉴别死活细胞的实验方法。
二、实验原理
酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。
三、试剂与器材
1.材料 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。
2.试剂 0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。
3.器材 显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。
四、实验内容
1.美蓝浸片观察 酵母培养→制片→染色→镜检→30分钟后再镜检
2.水-碘浸片观察
五、关键步骤及注意事项
1.染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。
2.用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。
实验八 微生物直接计数法及测微技术
一、实验目的
1.了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。
2.掌握用测微尺测定微生物大小的方法。
二、实验原理
显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(见图2—3—44)；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。若设5个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板，则计算方法为：
lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数×25×104×M=50000N·M(个)
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长0．01mm(即10pm)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。
三、试剂与器材
1.材料 酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。
2.实验器材 细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。
四、实验内容
1.微生物直接计数法 菌悬液制备→镜检计数室→加样品→显微镜计数→清洗血细胞计数板
2.微生物测微技术 装目镜测微尺→校正→菌体大小测定
五、关键步骤及注意事项
1.防止加样空气泡产生。
2.调节显微镜光线的强弱适当。
实验九 大肠杆菌生长曲线的测定
一、实验目的
1.了解大肠杆菌的生长曲线特征和繁殖规律，并学会绘制生长曲线。
2.复习光电比浊法测量细菌数量的方法。
二、实验原理
将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。
三、试剂与器材
1.材料与试剂 大肠杆菌、LB液体培养基70ml、分装2支大试管(5ml／支)、剩余60ml装入250ml的三角瓶。
2.器材 722型分光光度计、恒温振荡摇床、无菌试管、无菌吸管等。
四、实验内容
编号→接种→培养→比浊测定
五、关键步骤及注意事项
1.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定
2.严格控制培养时间
实验十 水中细菌总数的测定
一、实验目的
1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2.了解水源水的平板菌落计数的原理。
二、实验原理
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
三、试剂与器材
1.试剂 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水
2.器材 灭菌三角瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四、实验内容
1.水样的采取
2.细菌总数测定
3.菌落计数方法
五、关键步骤及注意事项
1.注意全过程防止染菌
实验十一 细菌细胞的生化反应实验
一、实验目的
了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法。
二、实验原理
各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。
糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧化碳、氢、甲烷等)，而有些细菌只产生酸不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来判断。在培养基中加入溴甲酚紫(pH5．2为黄色，pH6．8为紫色)，当发酵产酸时，使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出现来验证．
三、试剂与器材
1.材料大肠杆菌、普通变性杆菌、产气杆菌、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基。
2.试剂甲基红试剂、40％KOH、5％a一萘酚、乙醚、吲哚试剂。
3.实验器材德汉氏小管、试管、接种环、恒温培养箱。
四、实验内容
培养基配制→编号→试管→接种→培养→观察结果
五、关键步骤及注意事项
1.要严格按照培养基配方配制培养基。
2.观察结果时要注意滴加药量及反应时间。
实验十二 噬菌体的分离、纯化及效价测定
一、实验目的
1.学习分离、纯化噬菌体的原理和方法
2.观察噬菌斑的形态和大小
3.掌握噬菌体效价测定的基本方法
二、实验原理
噬菌体是细菌的专性寄生物，自然界中凡是有细菌存在的地方，均可以发现其特异性的噬菌体，噬菌体侵入细菌细胞后，利用宿主细胞的酶系统进行复制和增殖，最终导致细菌细胞裂解，噬菌体从细胞中释放出来，可以进一步侵染细菌细胞。在液体培养基中，噬菌体可以使浑浊的菌悬液变为澄清。在长有宿主细菌的固体培养基平板上，噬菌体可以裂解细菌形成透明的空斑，即噬菌斑，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此可以利用这个性质对噬菌体进行分离和效价的测定。
噬菌体的效价是指噬菌体的浓度，即一毫升培养液中所含有的噬菌体数量。噬菌体效价的测定方法多采用双层琼脂平板法。先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。
三、试剂与器材
1.材料大肠杆菌、牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨半固体培养基(含有琼脂0．5％，试管分装，每管3～5m1)、三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基。
2.器材培养皿、无菌吸管、三角瓶、抽滤瓶、蔡氏细菌滤器、真空泵、阴沟污水。
四、实验内容
噬菌体分离→噬菌体纯化→效价测定
五、关键步骤及注意事项
1.噬菌体时要注意细菌滤器的型号。
2.纯化噬菌体时要注意形态、大小。
3.效价测定时要注意双层琼脂平板法的使用技巧。
㈡ 什么是微生物免培养技术
其通自选育工选育两类单独使用交叉进行 DNA Shuffling技术 编辑 随着PCR技术发展应用1994美stemmer提全新工进化技术——DNA Shuffling（称洗牌技术）该技术能模拟物数百间发进化程并短实验循环定向筛选特定基编码酶蛋白性提高几百倍甚至万倍功能性突变基其基本原理源同功能相同组同源基用DNA核酸酶I进行消化 产随机片段由些片段组文库使互引物模板进行PCR扩增基拷贝片段作另基拷贝引物引起模板转换重组发导入体内选择突变体作新轮体外重组般通2-3循环课获产物幅度提高重组突变体 2自选育 编辑 自界微物未经工诱变或杂交处理情况进行离纯化（见微物离纯化）进行纯培养测定（见微物测定）择优选取微物菌种种简单易行获优良菌种几率般难满足产需要 3工选育 编辑 诱变育种杂交育种两种 诱变育种 诱发基突变手段微物育种技术1927H.J. 马勒发现X射线增加突变率效；1944C.奥尔巴克首发现氮芥气诱变效应；随陆续发现许物理（紫外线、γ射线、快等）化诱变素化诱变素3种：①诱变剂与或核酸碱基发化变化使DNA复制碱基置换引起变异羟胺亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亚硝基甲基脲等；②诱变剂碱基结构类似物复制参入DNA引起变异5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤2-氨基嘌呤等；③诱变剂DNA减少或增加1～2碱基使碱基突变点全部遗传密码转录翻译发错误导致码组移突变体现吖啶类物质些氮芥衍物（ICR）等诱变育种操作简便突变率高突变谱广仅能提高产量改进质量扩产品品种简化工艺条件1943自界离青霉素产菌效价20单位/毫升经系列诱变育种效价已达40000单位/毫升；金霉素产菌经诱变发酵液积累甲基金霉素；谷氨酸棒杆菌1299经紫外线诱变能产赖氨酸能产缬氨酸增加产品种类；土霉素产菌经诱变选能减少泡沫突变菌株提高发酵罐利用率诱变育种足缺乏定向性 杂交育种 同基型品系或种属间通交配或体细胞融合等手段形杂种或者通转化转导形重组体再些杂种或重组体或代筛选优良菌种通种离具新基组合重组体选由于具杂种优势旺盛、物量、适应性强及某些酶性提高新品系杂交育种式实验菌株殖式同异性杂交、准性重组、原质体融合、转化、转导、杂种质粒转化等；选择亲株、离群体代培养、择优劣杂种遗传析程基本相同杂交般指交配反应菌株进行交配或接合形杂种种适用范围广酒类、面包、药用饲料酵母育种链霉菌青霉菌抗素产量提高曲霉酶性增强等面均已获功 体细胞融合具性反应品系或种属间细胞融合染色体重组先用酶溶解细胞壁再用氯化钙-聚乙二醇处理原质体促使融合获杂种工业微物菌种改良积极作用 转化转导首先应用于细菌现已广泛用于链霉菌酵母菌等随着重组DNA技术发展重组质粒构建转化系统确立已目基转移受体细胞内能产具重要经济价值物性物质（疫苗、酶等）株系 微物与酿造工业、食品工业、物制品工业等关系非密切其菌株优良与否直接关系种工业产品坏甚至影响质量所培育优质、高产微物菌株十必要微物育种目要物合代谢途径朝所希望向加引导或者促使细胞内发基重新组合优化遗传性状使某些代谢产物量积累获所需要高产、优质低耗菌种作途径诱变育种直广泛应用目前内微物育种界主要采用仍规物理及化等诱变外原质体诱变技术已广泛应用于酶制剂、抗素、氨基酸、维素等菌种选育并且取许重应用意义 4诱变育种 编辑 1.1物理诱变 1.1.1紫外照射 紫外线照射用物理诱变诱发微物突变种非用工具DNA RNA 嘌呤嘧啶吸收峰260nm260nm 紫外辐射效致死剂紫外辐射作用已种解释比较确定作用使DNA 形嘧啶二聚体[1]二聚体形阻碍碱基间配所能导致突变甚至死亡[2] 紫外照射诱变操作简单经济实惠般实验室条件都达且现突变几率较高酵母菌株诱变采用种 1.1.2电离辐射 γ- 射线电离物应用广泛电离射线具高能量能产电离作用,直接或间接改变DNA 结构其直接效应氧化脱氧核糖碱基或者脱氧核糖化键糖- 磷酸相连接化键其间接效应能使水或机产自由基些自由基与细胞溶质发化变化导致DNA 缺失损伤[2] 除γ- 射线外电离辐射X- 射线、β- 射线快等电离辐射定局限性操作要求较高且定危险性通用于能使用其诱变剂诱变育种程 1.1.3离注入 离注入20 世纪80 代初兴起项高新技术主要用于金属材料表面改性1986 逐渐用于农作物育种近微物育种逐渐引入该技术[3] 离注入物吸收能量并且引起复杂物理化变化些变化间体各类性自由基些自由基引起其物损伤使细胞染色体突变DNA 链断裂使质粒DNA 造断裂由于离注入射程具控性随着微束技术精确定位技术发展定位诱变能[4] 离注入进行微物诱变育种般实验室条件难达目前应用相较少 1.1.4 激光 激光种光量流称光微粒激光辐射通产光、热、压力电磁场效应综合应用直接或间接影响机体引起细胞染色体畸变效应、酶激或钝化及细胞裂细胞代谢改变光量细胞内含物任何物质旦发作用都能导致物机体细胞遗传特性发变异同种类激光辐射物机体所表现细胞遗传变化同[5] 激光作种育种具操作简单、使用安全等优点近应用于微物育种取少进展 1.1.5 微波 微波辐射属于种低能电磁辐射具较强物效应频率范围300MHz~300GHz物体具热效应非热效应其热效应指能引起物体局部温度升引起理化反应；非热效应指微波作用物体产非温度关联各种理化反应两种效应综合作用物体产系列突变效应[6] ,微波用于领域诱变育种农作物育种、禽兽育种工业微物育种并取定 1.1.6 航育种 航育种称空间诱变育种利用高空气球、返式卫星、飞船等航器作物种、组织、器官或命体搭载宇宙空间利用宇宙空间特殊环境使物基产变异再返面进行选育培育新品种、新材料作物育种新技术空间环境素主要微重力空间辐射及其诱变素交变磁场超真空环境等些素交互作用导致物系统遗传物损伤使物发诸突变、染色体畸变、细胞失、发育异等 航育种较其育种特殊航技术与微物育种技术机结合技术含量高本高体研究者或般研究单位都难实现能与航技术相结合由家完 1.1.7 压室温等离体诱变育种 压低温等离体（Atmospheric and Room Temperature Plasma）简称ARTP指能够气压产温度25-40 °C间、具高性粒（包括处于激发态氦原、氧原、氮原、OH自由基等）浓度等离体射流ARTP技术作种新型物理微物诱变育种领域着广阔应用前景 等离体适剂量性粒作用于微物能够使微物细胞壁/膜结构及通透性改变并引起基损伤菌株现遗传物质损伤微物启SOS修复机制其诱导产DNA聚合酶ⅣV具3ˊ核酸外切酶校功能于DNA链损伤部位即使现配碱基复制仍能继续前进情况允许错配增加存机ARTP遗传物质造损伤性较高；SOS诱导修复本身容错性修复ARTP性损伤能修复程包容于DNA链微物进行复制修复其能带性错配能 ARTP应用于微物突变育种本低、操作便没物理诱变设备（离束注入等）所需离或电加速、真空制冷等附属设备；ARTP遗传物质损伤机制具较高突变率突变性能于真菌、细菌、藻类等都效；ARTP环境污染保证操作者身安全论用何种气体放电其均害气体产[1] 5化诱变 编辑 2.1.1 烷化剂 烷化剂能与或几核酸碱基反应引起DNA 复制碱基配转换发遗传变异用烷化剂甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等 甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulphonate,EMS) 用烷化剂诱变率高诱导突变株数点突变该物质具强烈致癌性挥发性用5%硫代硫酸钠作终止剂解毒剂 N- 甲基- N'- 硝基- N- 亚硝基胍（NTG) 种超诱变剂应用广泛定毒性操作应该注意碱性条件NTG 形重氮甲烷（CH2N2）引起致死突变主要原效应能CH2N2 DNA 烷化作用引起[2] 硫酸二乙酯（DMS) 用由于毒性太强目前少使用乙烯亚胺产较少难买使用浓度0.0001%~0.1%高度致癌性使用需要使用缓冲液配置 2.1.2 碱基类似物 碱基类似物结构类似碱基掺入DNA 导致DNA 复制产错配mRNA 转录紊乱功能蛋白重组表型改变该类物质毒性相较负诱变率高往往易突变体主要5- 氟尿嘧啶（5- FU) 、5- 溴尿嘧啶（5- BU) 、6- 氯嘌呤等程世清等[25]用5- BU 产色素菌（枝杆菌T17- 2- 39） 细胞进行诱变物量平均提高22.5%. 2．1.3 机化合物 诱变效般危险性较用氯化锂白色结晶使用配0.1%~0.5%溶液或者直接加诱变固体培养基作用间30min～2d亚硝酸易解所现配现用用亚硝酸钠盐酸制取亚硝酸钠配0.01~0.1mol/L 浓度使用加入等浓度等体积盐酸即 2.1.4 其 盐酸羟胺种原剂作用于C 使G- C 变A- T较用,使用浓度0.1%～0.5%作用间60min～2h 外诱变两种或种诱变复合使用或者重复使用同种诱变效更佳顾华等[7]谷氨酸棒杆菌ATCC- 13761 发菌株经DMS NTG 诱变处理获株L- 组氨酸产菌 2、诱变剂 2.1 诱变剂选择 选择诱变剂需要注意诱变剂专性即某诱变剂或诱变处理优先使基组某些部发突变别部即使少发突变诱变剂专性基础十解万尽管关修复途径必定影响关系并简单其各种素包括诱变处理环境条件能影响突变类型 工业遗传家难确预言改良某菌种需要何种类型水平突变产类型尽能突变体适采用几种互补类型诱变处理远紫外疑所诱变剂合适似乎诱导所已知损伤类型采取效、安全预防容易化诱变剂液体试剂比粉末试剂更易进行安全操作另利素产紧密连锁突变丛趋势尽管种效应某些体系能利条件必须认识能某些特异菌系用某些诱变剂能诱变点通测定易检突变体抗药性突变体或原养型复突变体诱变力相容易验证[8] 2.2 诱变剂剂量 随机筛选佳效看诱变剂适剂量用于筛选存群体高比例所需要突变体使测定效价阶段更省力 菌株改良前决定所用诱变剂适剂量并突变性增强技术打基础聪明做通测定同诱变剂处理同菌种突变力用高单位突变本身测定适剂量能种突变检测困难使用容易检标记耐药标记要估计局限性提供些价值资料
㈢ 如何进行微生物的培养
微生物对营养要求一般都不高，农副产品、工厂下脚料都可以用来培养微生物。沼气发生池就是利用粪便、草木纤维等生产沼气的。大多数微生物的反应条件温和，能在常温常压下生长繁殖，不需要昂贵的设备，这比用化学法生产化工原料要优越得多。微生物培养不受季节、气候影响，因而能长年累月地进行工业化生产。
㈣ 微生物分离和纯培养技术有哪些
微生物的培养方式
1．分批培养（batchculture）将微生物置于一定容积的培养基中，经培养，最后一次收获，谓分批培养。在分批培养中，培养基一次加入，不予补充，不再更换。由于营养消耗，代谢产物积累，对数生长期不能长期维持。
2．连续培养（continuous culture）在培养器中不断补充新鲜营养物质，并不断排出部分培养物（包括菌体和代谢产物），以保持长时间生长状态的一种培养方式。主要有恒浊连续培养和恒化连续培养两类。恒浊连续培养通过不断调节流速，使培养液浊度保持恒定，因而可不断提供具有一定生理状态的细胞，并可得到以最高生长速率进行生长的培养物。恒化连续培养通过控制恒定的流速使营养物浓度基本恒定，从而使微生物保持恒定的生长速率。用不同浓度的限制性营养物进行恒化培养，可得到不同生长速率的培养物。
3．半连续培养（semi-continuous culture）在发酵罐中的一部分发酵液保留下来作为菌种液，放出其余部分进入提练加工工序，在剩余的培养液中加满新的未接种的培养液，继续培养，如此反复，谓之半连续培养。
4．补料分批培养（fed-batch culture）补料分批培养又称半分批培养，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养液，但不取出培养物。待培养到适当时期，将其从反应器中放出，从中提取目的生成物（菌体或代谢产物）。若放出大部分培养物后，继续进行补料培养，如此反复进行，则称为重复补料分批培养（repeated fed-batch culture）。与传统分批发酵相比，补料分批发酵的优点在于使发酵系统中的基质浓度维持在低水平，这有以下优点：①可除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，以减轻供氧矛盾；②避免有毒代谢物的抑菌作用；③大为减少了无菌操作要求十分严格的接种的次数。与连续发酵相比，补料分批培养不会产生菌种老化和变异等问题。故其应用范围十分广泛。
5．同步培养 能使培养的微生物处于较一致的，生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法。利用同步培养法控制细胞的生长，使它们处于同一生长阶段，所有细胞都能同时分裂，这种生长方式叫同步生长（图3—4）。用同步培养法得到的培养物叫同步培养物（synchronous culture）。这样，群体和个体行为一致，即可用研究群体的方法来研究个体水平上的问题。由于同步群体的个体差异，同步生长往往最多维持2个～3个世代，然后又逐步变为随机生长。
青岛海博生物技术有限公司，主要从事生物、医学及相关领域的产品技术研究、开发和销售，涉及分子生物学、生物化学、医用诊断试剂以及各种微生物、检验用培养基等诸多方面。
海博生物技术有限公司现有产品：干燥培养基、显色培养基、常规检验培养基、药典培养基、植物组织培养基、运送培养基、临床检验培养基、动物疫苗培养基、一次性平板等。
干燥培养基：有600多个品种,采用法国进口原料制作, 质量稳定、特异性好,并在不断开发新产品。
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㈤ 研究微生物的重要经典技术有哪些
微生物学的研究方法和技术有：
显微技术，纯种培养技术，无菌技术，纯种分离纯化技术和微生物保藏技术。
显微技术（micros）：显微技术是利用光学系统或电子光学系统设备，观察肉眼所不能分辨的微小物体形态结构及其特性的技术。包括：①各种显微镜的基本原理、操作和应用的技术；②显微镜样品的制备技术；③观察结果的记录、分析和处理的技术。
纯培养：纯培养最重要的是在于微生物的生理研究，方法是依靠灭菌和分离，是由巴斯德（L．Pasteur）和柯赫（R．Koch）建立起来的。在自然界中，有的培养条件很困难，特别是具有密切共生关系的生物及进行寄生性营养的生物；也有一些在理论上不可能进行纯粹培养的生物。纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。
无菌技术：无菌技术是在医疗护理操作过程中，保持无菌物品、无菌区域不被污染、防止病原微生物 侵入人体的一系列操作技术。无菌技术（aseptic technique） 是指在执行医疗、护理技术过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。
纯化：纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。
㈥ 什么是微生物培养技术
“微生物的利用”包括“进行微生物的分离和培养”、“测定某种微生物的数量”、“研究培养基对微生物的选择作用”和“尝试利用微生物进行发酵来生产特定的产物”四项具体内容标准，按照相关内容标准的要求，结合人教版教材所对应的实验课题，本文将谈谈对本专题的教学组织。
1 习得微生物培养的基础知识和基本技能
本专题涉及三个实验课题，它们的关系及学习要求如下图所示。在下图中，课题1涉及微生物培养的基础知识和基本的操作技能，是其他两个课题的基础，课题2和课题3涉及特定的微生物的分离、计数和鉴定，难度较大，课题2强调选择性培养基的配制和作用，课题3是在选择性培养基的基础上，又相应地增加了鉴别性培养基的知识及其应用。
1.1 配制微生物培养基 配制培养基的基础知识是培养、观察和研究微生物的基础。教学时，可以先展示有菌落生长的培养基平板，给学生以视觉刺激，让他们体会到要观察和研究微生物，必须创设一定的条件让微生物大量快速地繁殖起来，只有形成具有一定特征的菌落，才能更好地研究微生物。进而向学生提供几种微生物培养基的配方，让学生通过比较分析各种配养基配方，明确微生物培养基的基本成分包括：碳源、氮源、无机盐和水，有些微生物还需要某些特殊的生长因子。然后，依次阐明固体、半固体和液体培养基的用途和配制方法，并结合下面的流程图概述培养基配制的操作步骤：
组织学生配制微生物培养基时，要向他们讲清下列注意事项：（1）溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦；（2）加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度；（3）分装至试管时培养基的高度不要超过试管高度的1/5；（4）一般是培养基先灭菌再倒平板，也可先倒平板,课间再灭菌；（5）冷却后的平板要倒置，以确保拿放方便，同时避免水分蒸发，以利微生物生长。
1.2 无菌技术操作无菌技术是培养、分离和纯化微生物的重要技术手段，也是植物组织培养的关键性操作。教学时，要先让学生正确区分消毒和灭菌这两个概念，并充分认识无菌操作的重要性；然后，在教师的组织和指导下进行规范、熟练地操作，以便顺利完成微生物的培养、分离和纯化等实验。下表是消毒和灭菌的一些常用方法及使用范围。
定义
常用方法
微生物培养和组培的应用
消毒
使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分菌体,但不伤及活组织
煮沸
玻璃仪器
紫外线
实验室、操作台、衣物等
酒精溶液
手、外植体等
次氯酸钠溶液等
外植体
灭菌
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有菌体、芽孢和孢子
高压蒸汽
培养基、玻璃仪器、棉塞、牛皮纸等
灼烧
接种环、涂布器等
干热
玻璃仪器
1.2.1 接种的方法及作用 微生物接种方法有两种，一是划线接种，即用接种环划线将菌体沾在斜面培养基或平板培养基上。微生物的生长和繁殖迅速，一段时间后，就会在培养基表面形成长满菌落的细线。划线法的作用是纯化微生物，通过划线将微生物单个地分离，并最终形成标准的菌落；二是涂布接种，即用涂布器将稀释菌液均匀地涂布在平板上。一个菌体在培养基平板上形成一个菌落，通过统计菌落数可以计算样品中的菌体数目。
1.2.2 规范实验操作 接种过程的无菌操作是微生物实验的关键环节，右图为划线接种的操作示意图，下表列出划线接种的基本步骤和说明。教学中，要求学生认真领会无菌接种的技术原理，反复练习操步骤作。通过练习达到熟练程度，并培养严谨认真的科学精神和一丝不苟的实验态度。
序列
操作步骤
分析说明
1
将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红
将接种环灭菌，避免污染菌种
2
在火焰旁冷却接种环，拔除盛有菌液的试管棉塞
避免杂菌污染菌种
3
将试管口通过火焰
灼烧灭菌，防止试管口菌体污染培养基
4
将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取菌液
冷却接种环可避免杀死菌种
5
将试管口通过火焰，并塞上棉塞
避免试管口杂菌污染菌种
6
左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
初步接种。划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准
7
灼烧接种环，冷却后从第一区划线的末端向第二区划线。重复以上操作，在第三、四、五区划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
从上个区域的末端向下个区域划线,可逐步分离出单个菌体，从而实现微生物的纯化
8
将平板倒置，放入培养箱中培养
倒置平板防止水分蒸发，也方便拿放
1.3 稀释菌液的意义和操作方法 在单位体积的菌体培养液内，含有的微生物个体数目很多。要对微生物进行分离和计数必须将菌液稀释，只有在稀释度足够高的菌液里，聚集的微生物才能分散成单个细胞。一般将菌液稀释到10-3～10-7时，接种后可能在培养基平板上形成30～300个左右的菌落，统计的菌落数也比较准确可信。
用移液管和无菌水稀释微生物菌液是一件要求较高的操作技术，学生需要经过多次练习才能做到尽量地减少误差。 以土壤为样品进行稀释操作的注意事项是：（1）初次称量的土壤样品，稀释后的菌液浓度较大，移液时极容易堵塞移液管或吸入较多的土壤颗粒，应静置一段时间后再移液，或者用低速离心机离心1分钟后进行移液；（2）当稀释倍数大时，在稀释前一定要震荡试管，充分混合菌液，保证移液操作的准确性；（3）每次移液前一定要注意用无菌水（或蒸馏水）清洗移液管并用气球吹干，以保证移走菌液的浓度与试管中的一致。
2.实验设计能力的训练
2.1 选择性培养基的实验设计 根据功能的不同，培养基分为选择性
培养基和鉴别性培养基，在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验中，先让学生通过分析和判断下面的三个培养基配方，真正理解选择性培养基的含义。然后，启发学生设计一组用于分离尿素细菌的探究实验，帮助学生理解选择性培养基的特性及作用。
组别
培养基类型
是否涂布接种
目的
实验组
以尿素为唯一氮源的培养基
是
分离尿素细菌
对照组
牛肉膏、蛋白胨培养基
是
判断该培养基有无选择性
2.2 鉴别性培养基的实验设计 在“分解纤维素的微生物的分离”实验中，要鉴别筛选出来的微生物是不是分解纤维素的微生物，就必须用鉴别性培养基。刚果红与纤维素等多糖类物质反应形成红色复合物，添加刚果红的培养基呈红色，接种的微生物若能够分解纤维素，就会在其菌落的周围形成透明圈。值得注意的，培养基的琼脂中含有淀粉类物质，产生淀粉酶的微生物在培养基上也会形成透明圈；也有些微生物具有降解刚果红的能力，培养时间过长，也会在菌落周围出现透明圈。与分解纤维素形成的透明圈相比，这两种透明圈小而模糊，因此，本实验最好先用选择性培养基筛选分解纤维素的微生物，再配制鉴别性培养基进行“分解纤维素的微生物的分离”的实验。
3 教学实施的前期准备
3.1提前准备好实验仪器、设备和药品 为方便大家提前做好准备，现以人教版教材为例，将本专题所需要的仪器、设备和药品列表如下：
课题名称
实验仪器和设备
实验试剂或药品
说明
微生物的实验室培养
培养皿、试管、锥形瓶、量筒、酒精灯、电子天秤、高压蒸汽灭菌锅、移液管、接种环、涂布器、恒温箱、干热灭菌箱、小铁铲等
牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、琼脂等
干热灭菌箱能够迅速地将洗干净的培养皿和试管烘干，小铁铲用于铲土
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
除配制牛肉膏蛋白胨培养基所需物质外，增加KH2PO4 、NaHPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、酚红等
分解纤维素的微生物的分离
除配制牛肉膏蛋白胨培养基所需物质外，增加纤维素、NaNO3、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、KCl、酵母膏、水解酪素、CMC-Na(羧甲基纤维素钠)、土豆汁、刚果红等
3.2 做好课时安排及计划 以下为本专题的三个课题的课题数及其说明。
课题名称
课时数
说明
微生物的实验室培养
4
配养基的基本知识及配制方法1；配制培养基及倒平板1；纯化大肠杆菌和涂布接种1，观察分析1
分离土壤中分解尿素的细菌
3
基本原理及实验设计1；样品稀释及涂布接种1；对菌落进行统计及实验的分析与讨论1；在第二和第三课时之间需要间隔2天时间
分解纤维素的微生物的分离
3
基本原理及实验设计1；样品稀释及涂布接种1；对菌落进行统计及实验的分析与讨论1；在第二和第三课时之间需要间隔2天时间
3.3 安排好教学班的实验顺序 微生物实验涉及较多的实验仪器，而且实验时需要课内和课外相结合，如实验室培养需要学生在课堂上完成两项重要的操作步骤，一是配制培养基并倒平板；二是接种操作。平板灭菌工作由于需要较长的时间，因此只能由教师在课间完成。为保证每位学生都能亲手操作，保证各个教学班能在有限时间内完成实验任务，教师可采取如下的教学流程和教学安排。
3.4 做好课后的观察与记录 配制培养基和接种操作可以在课堂上完成，但接种后的平板放入培养箱中需要培养2～3天，这期间可安排生物科代表或部分小组长进行定期观察，并做好计录，以便及时让其他学生观察到自己的实验成果。特别需要说明的是，如果学生不能及时观察，培养的时间过长，很多菌落就会联成一片，计数时就无法做到准确有效。
4.实验中需要注意的安全操作
微生物本身就是危险生物，实验操作中又涉及到消毒、灭菌和接种等基本环节，因此要对学生进行安全教育，确保学生的安全和实验的顺利进行。一是操作安全，接种时要注意避免手被酒精灯火焰灼伤，接种后要及时提配学生洗手，以防止被微生物感染；二是环境安全，使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
㈦ 高中生物微生物的培养技术
标记应该是指用携带某种同位素的营养物质制作培养基，这样培养基就被标记，然后把微生物放在这个培养基上培养，培养出的微生物就被标记了哦。
㈧ 微生物培养技术常用哪些设备，功能如何
微生物培养常用的设备有:
恒温箱，提供恒温环境
振荡器，振荡增氧
高压蒸汽灭菌锅，灭菌
㈨ 概述微生物纯培养的基本技术及其原理
纯培养
pure
culture，axenic
culture
系指只在单一种类存在的状态下所进行的生物培养。所有微生物、植物和动物都可以进行这种培养，高等植物或动物的无菌培养（无菌饲养）也可说是一种纯培养。纯培养最重要的是在于微生物的生理研究，方法是依靠灭菌和分离，是由巴斯德（L．Pasteur）和柯赫（R．Koch）建立起来的。在自然界中，有的培养条件很困难，特别是具有密切共生关系的生物及进行寄生性营养的生物；也有一些在理论上不可能进行纯粹培养的生物。
纯培养(pure
culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.
如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure
culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化
㈩ 微生物培养方法
微生物培养所培养的微生物通常是病菌、细菌、放线菌、真菌等，属于生物培养的一种。
微生物培养步骤：
1.配置不同浓度的营养液稀释液:取营养液1ml溶于9ml无菌水中,振荡 5min配成10%的溶液.
2.将容器口靠近(注意不是对着)酒精灯灯焰用吸管从此溶液中吸取1ml加入到装有9ml无菌水的试管中.以此类推制成1%,0.1%,0.01%等不同浓度的稀释液.
3.将试管口靠近(注意不是对着)酒精灯灯焰,左手拿试管,右手托培养皿(仅露一条小缝,且靠近灯焰).将溶液倒入培养皿中,在各培养皿上标上浓度.
4.将有细菌生长的样品容器口靠近(注意不是对着)酒精灯灯焰,用接种环挑取菌落上的少量菌体加入10%的营养液中.把接种环放在酒精灯上灼烧灭菌,再次取样加入盛1%的营养液的培养皿(仅露一条小缝,且靠近灯焰)中.重复这个操作,将各浓度的营养液接上种.
5.轻轻摇匀接上种的培养皿,置于恒温箱内37摄氏度保存,3天后就有菌落出现.